Vysokorozlišovací analýza křivek tání (HRM) jako nástroj moderní diagnostiky

Autoři:

Radek Blatný

Pracoviště:

KRD Praha

Vysokorozlišovací analýza křivek tání (HRM) je vysoce citlivá a rychlá metoda, kterou lze využívat k záchytu jedno- i vícenukleotidových záměn a indelů v DNA v heterozygotním stavu. Vysokého rozlišení je dosahováno použitím tzv. DNA saturujících barviv, například barviva LCGreen (IdahoTechnology Inc., USA) nebo ResoLight (Roche, USA) atd., a pomocí přístrojů s vysoce přesnou a stabilní kontrolou časového teplotního gradientu (LightScanner 96 od fi. IdahoTechnology Inc., LightCycler 480 od fi. Roche atd.). Během postupného zahřívání dochází k tavení dvoušroubovice DNA, čímž se z ní barvivo uvolňuje a dochází k poklesu fluorescence. Přítomnost heteroduplexu v analyzovaném amplikonu DNA mění tvar křivky tání, který je charakteristický pro konkrétní záměnu na konkrétní pozici daného amplikonu a v některých případech umožňuje dokonce zachycení homozygotní varianty polymorfních oblastí. HRM lze v moderních diagnostických laboratořích využívat k detekci nádorových onemocnění, jelikož až 10 % z nich je způsobeno dědičnou dispozicí. V rodinách s opakovaným výskytem určitých nádorů je proto vhodné provádět preventivní genetická vyšetření.
Servisní laboratoř KRD, vybavená přístroji LightScanner a LighCycler 480, nabízí návrh esejí i komerční zpracování vzorků pomocí microarray analýzy, real-time kvantitativní PCR a vysokorozlišovací analýzy křivek tání (HRMA) pro akademické i komerční subjekty. V roce 2011 byl zahájen vývoj nových komerčních kitů, na bázi HRM, detekujících mutace, které jsou známými dědičnými nádorovými predispozicemi u relativně běžných (nádory prsou, kolorektální karcinom, karcinom vaječníků, karcinom plic) i vzácných dědičných variant některých onemocnění (dermopatie, myopatie, dystrofie, neurodegenerativní choroby, neuropatie, progerie). HRM eseje jsou navrhovány pomocí softwaru LightScanner Primer Design (Idaho Technology Inc., USA) a jejich specificita a nepřítomnost nežádoucích sekundárních struktur následně ověřena pomocí volně dostupných nástrojů funkční genomiky (UCSC genome browser, dbSNP, Beacon Designer od fi. Premier Biosoft). Po počátečním testování na kontrolních vzorcích je jejich funkce důkladně ověřena na větším počtu pacientských vzorků.
Nezanedbatelným aspektem HRM analýzy je možnost zlevnění současných běžných klinických diagnostických postupů, obvykle založených na přímém sekvenování. Kombinací pre-skenovací HRM analýzy a následného selektivního sekvenování lze náklady na tato vyšetření několikanásobně snížit.

Forma prezentace:

Přednáška - firemní