Od RFLP po NGS – vývoj molekulárně-genetické analýzy u pacientů s polycystickou chorobou ledvin

Autoři:

Jitka Štekrová (1), Jana Reiterová (1,2), Veronika Elišáková (1), Petr Lněnička (1), Miroslav Merta (1), Vladimír Tesař (2), Milada Kohoutová (1)

Pracoviště:

  1. Ústav biologie a lékařské genetiky, 1. LF UK a VFN v Praze
  2. Klinika nefrologie, 1. LF UK a VFN v Praze

Autozomálně dominantní polycystická choroba ledvin (ADPKD - Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease) je nejčastějším dědičným onemocněním ledvin. Onemocnění je charakterizováno progresivním růstem renálních cyst a postupnou ztrátou renální funkce. Onemocnění může být způsobeno mutací genu PKD1 (MIM 601313; 85 % případů) nebo genu PKD2 (MIM 173910; 14 % případů). Proteinové produkty obou genů, polycystin -1 a polycystin-2, jsou membránové proteiny, které v komplexu s dalšími proteiny regulují růst a diferenciaci renálních buněk již v časné embryogenezi. Mutační analýza genu PKD1 je komplikována vysoce homologní duplikací 2/3 genu a jeho značnou variabilitou. V mezinárodní databázi mutací (The PKD database: http://pkdb.mayo.edu) je v současnosti uvedeno 864 sekvenčních variant genu PKD1 a 139 sekvenčních variant genu PKD2.
Presymptomatická DNA diagnostika se v naší laboratoři provádí již více než 20 let metodou vazebné analýzy; v první polovině 90-tých let se prováděla pouze analýza genu PKD1 s využitím metody RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism). Od  druhé poloviny 90-tých let se vazebná analýza  provádí v lokusech obou genů s využitím vysoce polymorfních mikrosatelitních markerů. Uvedenými metodami bylo vyšetřeno již více než 500 nepříbuzných rodin s výskytem ADPKD.
Přímá detekce mutací v genech PKD1, 2 je v naší laboratoři prováděna převážně v rámci výzkumných projektů. V genu PKD1 bylo dosud detekováno 54 různých mutací v 57 nepříbuzných rodinách.  Pouze 2 mutace byly detekovány opakovaně. Ostatní identifikované mutace jsou unikátní pro jednotlivé rodiny; 42 z identifikovaných mutací nebylo dříve popsáno. V genu PKD2 bylo dosud detekováno 17 kauzálních mutací ve 36 nepříbuzných rodinách. Pět mutací bylo detekováno opakovaně; 14 identifikovaných mutací je unikátních pro naši populaci.
Technologie NGS (Next Generation Sequencing) na analyzátoru GS Junior (Roche) byla využita k analýze genu PKD1 v šestičlenné rodině s velmi variabilním fenotypem ADPKD. V rodině bylo identifikováno velké množství substitucí a lze sestavit rizikový haplotyp; nelze však určit jednoznačně kauzální mutaci, která je odpovědná za onemocnění v rodině. Na základě současných znalostí lze obdobný výsledek s nejednoznačnou  interpretací očekávat zhruba u 50% rodin s ADPKD. Nové technologie mohou jednoznačně zrychlit a zlevnit identifikaci nových mutací, které  přispějí k nalezení funkčně důležitých domén polycystinů a k objasnění molekulárního mechanizmu vzniku tohoto závažného onemocnění. Do budoucnosti lze očekávat rozšíření mezinárodních databází sekvenčních variant, které mohou mít význam pro interpretaci výsledků, stanovení prognózy, prevence a léčebných zásahů u jejich nositelů.  
Molekulárně-biologické metody, zejména vazebná analýza, v současnosti umožňují v rodinách s ADPKD presymptomatickou, prenatální a preimplantační diagnostiku.
Podporováno VZ MŠMT 0021620806

Forma prezentace:

Přednáška