Srovnání metod používaných při diagnostice mutací genu KRAS a EGFR u kolorektálního karcinomu (CRC) a nemalobuněčného karcinomu plic (NSCLC)

Autoři:

Monika Bajerová (1), Blanka Robešová (1), Lenka Ostřížková (1), Dagmar Brančíková (1), Jana Skřičková (2), Marcela Tomíšková (2), Jitka Kyclová (3), Jitka Hausnerová (3), Jiří Mayer (1), Dana Dvořáková (1)

Pracoviště:

  1. Interní hematoonkologická klinika FN Brno a LF MU Brno
  2. Klinika nemocí plicních a tuberkulózy FN Brno
  3. Ústav patologie FN Brno

Úvod: Mutovaný stav genu KRAS je uváděn u 40 % CRC pacientů. Mutace jsou spojovány s negativní prognózou pacienta ve vztahu k cílené léčbě monoklonálními protilátkami. U NSCLC pacientů je analyzován mutační stav genu EGFR a tyto mutace jsou spojovány s predikcí lepší odpovědi na léčbu EGFR tyrozinkinázovými inhibitory. Frekvence mutací EGFR je kolem 10 %. Stanovení uvedených aktivačních mutací je nezbytným předpokladem zahájení individuální cílené terapie.
Cíl: Provést srovnání dostupných laboratorních technik pro stanovení aktivačních mutací KRAS a EGFR genu z hlediska senzitivity, metodické a finanční náročnosti.
Metody: Pro izolaci genomové DNA byl použit QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (QIAGEN). Výchozím materiálem je formalínem fixovaná tkáň zalitá do parafinu (FFPE) po morfologické konfirmaci na pracovišti patologie. Pro detekci bodových záměn v kodonu 12 a 13 genu KRAS jsou zavedeny metody: HRM (high resolution melt), přímá sekvenace a StripAssay PGX K-ras (ViennaLab) (10 mutací v kodonu 12 a 13). Pro mutační analýzu genu EGFR metody: fragmentační analýza FA (exon 19), alelická diskriminace AD (L858R exon 21), přímá sekvenace (exon 19 a 21) a PNAClamp EGFR Mutation Detection Kit (PANAGENE) (29 somatických mutací v exonech 18-21). Metody jsou validovány externí kontrolou kvality (UK NEQAS).
Výsledky: Mutační analýza genu KRAS byla v období XI/2009-X/2011 provedena u 119 FFPE vzorků (85 pacientů) se záchytem 47 pozitivních vzorků (37 pacientů). Metodou HRM byla detekována mutace ve vzorcích 34 pacientů. U vzorků s více než 40 % zastoupením nádorových buněk byl typ záměny specifikován přímou sekvenací. U vzorků 3 pacientů byla záměna detekována pouze StripAssay PGX K-ras (ViennaLab). Bylo zachyceno 5 typů bodových záměn v kodonu 12 a 1 v kodonu 13. Citlivost HRM dosahuje 10 %, přímé sekvenování 25 %, StripAssay PGX K-ras (ViennaLab) 2 %.
Mutační status genu EGFR byl v období X/2010-X/2011 analyzován u 105 FFPE vzorků (100 pacientů). Bylo detekováno 10 aktivačních mutací: 3/100 (delece v exonu 19), bodové záměny: 1/100 (exon 18), 1/100 (exon 20) a 5/100 (exon 21). Citlivost metod pro detekce delecí v exonu 19: FA 5 %, přímé sekvenování 10 %. Detekční limit pro záchyt L858R v exonu 21: AD 5 %, přímé sekvenování 25 %. Citlivost PNAClamp EGFR Mutation Detection Kit je 2,5 %. Frekvence zachycených mutací odpovídá očekávaným četnostem: 37/85 pacientů (43,5 %) u KRAS a 10/100 pacientů (10 %) u EGFR.
Závěr: Uvedené techniky jsou vhodné pro rutinní genetickou analýzu mutací genu KRAS i EGFR. Jsou dostatečně senzitivní i robustní. Zařazení kitů zvyšuje senzitivitu záchytu mutací. Výhodou StripAssay PGX K-ras (ViennaLab) kitu je vysoká citlivost, široké spektrum zachycených mutací a malé množství vstupní DNA. Nevýhodou je vyšší náročnost provedení. U PNAClamp EGFR Mutation Detection Kit (PANAGENE) je předností rychlost provedení a počet detekovatelných mutací, nevýhodou nutnost velkého množství testovaného materiálu. Použití kitů zvyšuje finanční náklady oproti standardním metodám.

Forma prezentace:

Poster