Direct PCR – využití v rychlé prenatální diagnostice trizomie chromozomu 21

Autoři:

Kristína Kovačovicová (1, 3), Iveta Valášková (1, 2), Jitka Kadlecová (1, 2), Eva Makaturová (1), Renata Gaillyová (1, 2)

Pracoviště:

  1. Oddělení lékařské genetiky, Laboratoř molekulární diagnostiky, FN Brno, Černopolní 9, 613 00 Brno
  2. Lékařská fakulta, Masarykova univerzita, Kamenice 5, 625 00 Brno
  3. Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Kotlářská 2, 611 37 Brno

Trizomie chromozomu 21 představuje nejčastější aneuploidii u člověka slučitelnou se životem. Udávaná frekvence výskytu je 1:600 novorozenců, přičemž více jak 60 % gravidit  končí smrtí plodu ještě před porodem. Je nejčastější příčinou mentální retardace, zahrnuje téměř 25 % všech případů mírné a těžké formy mentální retardace dětí v předškolním věku.
Prenatální diagnostika, založená na analýze buněk získaných z plodové vody, je používaná od šedesátých let minulého století. Původní diagnostika byla založena na určení kompletního karyotypu plodu. Hlavní nevýhodou tohoto přístupu je délka doby vyšetření, která představuje dva až tři týdny. Rychlejší alternativou je fluorescenční in situ hybridizace (FISH), která umožňuje získaní výsledku pro analyzované chromozomy za 24-48 hodin. V roce 1993 byla poprvé za účelem prenatální diagnostiky trizomie chromozomu 21 použita kvantitativní fluorescenční PCR (QF-PCR). Tato technika je založena na amplifikaci vysoko polymorfních krátkých tandemových repetící (STRs), nacházejících se na vybraných chromozomech, za použití fluorescenčně značených primerů v multiplexní PCR reakci. Přesnost této metody byla ověřena četnými studiemi, čas od přijetí vzorku po vydání výsledku je přibližně 24 hodin.
S cílem urychlit diagnostiku aneuploidie chromozomu 21 byla vytvořena sada pro QF-PCR, umožňující zkrácení doby diagnostiky Downova syndromu. Za použití Phusion® polymerázy (Phusion® Human Specimen DNA Polymerase, Finnzymes), která nevyžaduje izolaci DNA a v kombinaci s technikou fast PCR, je doba od příjmu vzorku do stanovení diagnózy výrazně zkrácena. Polymeráza, odvozená od enzymu z Pyrrococcus furiosus s přidaným uměle vytvořeným vazebným proteinem Sso7d odvozeným od Sulfolobus solfataricus, má 5´-3´ polymerázovou a 3´-5´ exonukleázovou aktivitu. Díky uměle vytvořené vazebné doméně (Sso7d) se vyznačuje robustností, vysokou procesivitou a přesností.
Vytvořená sada, sestávající ze dvou multiplexních reakcí, obsahuje primery pro 6 polymorfních STRs lokalizovaných v kritické oblasti pro vznik Downova syndromu (DSCR), 2 páry primerů pro odlišení maternální kontaminace od trizomie chromozomu 21 v mozaice (pro lokusy lokalizované na chromozomech 13 a 21) a 2 páry primerů pro určení pohlaví plodu (AMEL, SRY).
Doposud bylo tímto přístupem analyzováno 100 vzorků, z toho bylo 91 vzorků plodové vody, 5 vzorků periferní krve a 5 vzorků kontrolní izolované DNA s potvrzenou trizomií chromozomu 21. 81 vzorků plodové vody pochází z banky OLG FN Brno, kde jsou uchovávány po odběru pro případ další analýzy. K těmto vzorkům je k dispozici vypracovaný karyotyp, který byl porovnaný s výsledky Direct QF-PCR.

Forma prezentace:

Poster